更新時間:2024-06-20
乙酰fu酶A含量試劑盒,微板法乙酰輔酶 A 是能源物質代謝的重要中間代謝產物,在體內能源物質代謝中是一個樞 紐性的物質。
乙酰fu酶A含量試劑盒,微板法
乙酰fu酶A含量試劑盒,微板法
本試劑盒僅供科研使用 1 乙酰輔酶 A(Acetyl-CoA)含量測定試劑盒說明書 (貨號:WS6280W 微板法 96 樣) 一、產品簡介: 乙酰輔酶 A 是能源物質代謝的重要中間代謝產物,在體內能源物質代謝中是一個樞 紐性的物質。糖、脂肪、蛋白質三大營養物質通過乙酰輔酶 A 匯聚成一條共同的代謝 通路--三羧酸循環和氧化磷酸化,經過這條通路*底氧化生成二氧化碳和水,釋放能 量用以 ATP 的合成。它也是合成脂肪酸、酮體、膽*醇及其衍生物等生理活性物質的 前體物質。 蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和 NAD+生成草酰乙酸和 NADH。檸檬酸合酶可催化乙 酰輔酶 A 和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶 A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯反 應,乙酰輔酶 A 含量和 NADH 的生成量成正比,340nm 下吸光值的上升量反應了乙 酰輔酶 A 含量的高低。 二、試劑盒的組成和配制: 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 瓶 -20℃保存 部,再加 用前甩幾下或離心使試劑落入底 9mL 試劑一溶解備用。 試劑三 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部,再加 9mL 試劑一溶解備用。 試劑四 粉體 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部,再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品: 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、乙酰輔酶 A 含量測定: 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定,了解本批樣品情況,熟悉實驗流程,避免實驗 樣本和試劑浪費! 1、樣本制備: ① 組織樣本: 稱取約 0.1g 組織樣本,加 1mL 的提取液,進行冰浴勻漿,粗提液全部轉移到 EP 管 中,12000rpm,4℃離心 10min,上清液待測。 【注】:若增加樣本量,可按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例提取。 ② 細菌/細胞樣本: 先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次); 12000rpm 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。 【注】:若增加樣本量,可按照細菌/細胞數量(104):提取液(mL)為 500~1000:1 的比例進行提取。 2、上機檢測: ① 酶標儀預熱 30min,設定波長至 340nm。 ② 試劑解凍至室溫(25℃),在 96 孔板中依次加入:本試劑盒僅供科研使用 2 【注】若ΔA 差值較小如小于 0.005,可增加樣本取樣質量 W,如增至 0.2g 或更多,或增 加樣本加樣量 V1(如增至 60μL 或更多,則試劑二和三分別減少 20μL 相應減少), 則改變后的 V1 和 W 需代入公式重新計算。 五、結果計算: 1、按照樣本質量計算: 乙酰輔酶 A 含量(nmol/g 鮮重)=[ΔA÷ε÷d×V2×109]÷(W×V1÷V)=3215×ΔA÷W 2、按細胞數量計算: 乙酰輔酶 A 含量(nmol/104 cell)=[ΔA÷ε÷d×V2×109]÷(500×V1÷V)=6.43×ΔA ε---NADH 摩爾消光系數,6220 L/mol/cm; d---96 孔板光徑,0.5cm; V---提取液體積,1 mL; V1---加入樣本體積,20μL=0.02mL; V2---反應體系總體積,200μL=2×10-4L; W---樣品質量,g; 500---細胞數量,萬。 試劑名稱(μL) 測定管 樣本 20 試劑二 85 試劑三 85 混勻,室溫(25℃)下,5min 后于 340nm 處讀取 A1 值。 試劑四 10 混勻,室溫(25℃)下,反應 10min 后 于 340nm 處讀取吸光值 A2,ΔA=A2-A1。